罗丹明NHS 活化染料的常规标记方法

以标记高分子葡聚糖amino-dextran (40 kDa) 为例，讲述罗丹明NHS 活化染料的常规标记方法。对于特殊标记条件和要求，可以根据实验情况个体优化。标记准备工作:

1反应体系溶剂

标记反应可以采用纯有机溶剂体系(比如 DMSO，染料和dextran 都可以很好的溶解于DMSO)或者有机溶剂/缓冲液混合体系(比如DMF/PBS利用DMF 助溶染料)。NHS 活化酷在微碱性条件下反应的活性比较高，综合考虑反应速度和活化醋水解速度，一般选择在 pH 7.0-8.5左右的 pH 值范围进行标记反应。最优化的反应缓冲盐是 50 mM 的硼酸钠溶液(50mM Na:BO,pH8.5)。除此以外，磷酸钠缓冲盐 PBS (0.1M Na;PO,0.15M NaCIpH7.2-7.5)NaHCO;溶液(0.M NaHCO,pH8.3-9.0)也可以用于标记反应。带有氨基的缓冲液 (e.g.Tris 或甘氨酸)会自身和 NHS 活化反应，所以不可使用，如果样品中含有这些缓冲盐，必须通过透析或者除盐柱将这些氨基盐除掉后才可以用于标记反应。由于 dextran 本身很稳定，可耐受有机溶剂，本示例采用较高有机溶剂比例的 DMF/PBS(v/v=1/2)体系，以保证反应体系中染料的完全溶解。

2染料母液配制

染料的 NHS 活化对湿气很敏感。为了避免空气中水汽在低温样品表面凝结失活样品，低温冰箱中取出的活化在室内放置到室温后再打开瓶盖使用。染料NHS 活化酯不建议配置母液，而是单次直接使用，如果母液有剩余，可短暂保存于低温冰箱。罗丹明母液可以用DMF、DMSO、乙睛、甲醇等有机溶剂溶解，推荐母液浓度为 10mg/ml。母液也可以配制为 1mg/ml或者其它浓度，以便更准确的移液操作。

3染料标记比例 

为实现每个高分子标记大于1个染料分子的目标，在反应体系中，染料/标记对象的摩尔比例一般是 5-10/1;个别情况可以降低到约 3/1。为提高标记效率，应尽可能在高浓度、小反应体积条件中进行，比如标记大分子 dextran，dextran 的浓度最好在 1-10mg/ml，或者更高。水溶液中的标记反应，就是 NHS 活化酯的水解反应与氨基标记反应的赛跑，dextran 浓度高时，NHS 活化酯更多机会碰撞到氨基，反应机会多，效率就高。

上述推荐比例仅仅是新维创生物提供的参考比例，具体比例需根据个人预实验摸索后决定，因为标记的效率与对象结构、反应体积、反应溶剂、实验温度、反应时间和纯化方式都有关系。标记后以每个对象分子上偶联 1-4 个染料为最佳(视标记对象分子大小和实验需要而定)，标记过多可能会影响稳定性或者荧光淬灭，严重时会沉淀。标记反应步骤:

1将50mg amino-dextran 溶于 500 L的 PBS 中，将 dextran 溶液转移到反应小管中，用试剂检测溶液 pH 值，以确保其为 pH - 7.4。

2根据染料/dextran标记摩尔比例，取准确体积的染料母液，补加DMF至250pL，与上述21步骤1中dextran 溶液混合，用移液器上下轻轻打动混匀，或者轻微超声 1-2秒，使染料完全溶解。常温下静置或翘班摇床轻微晃动(更佳)，避光反应 1-5小时，反应时间延长有助于提高标记效率，可标记过夜。注意: 对于蛋白质等敏感材料，反应中的有机溶剂体积比最好控制在 5%以下，不建议超过 10%，反应时间也可视情况缩短。

3利用透析法，除去未标记的游离染料分子。透析前需对反应样品进行预处理: 加入 15 m的 PBS 或者去离子水，反应会出现沉淀，该沉淀为游离的罗丹明染料，加水后因为水溶性不足而沉淀出来，而标记产物 Rhod-dextran 水溶性强不会析出。10,000g 高速离心后取上清加入透析袋中透析。为了快速的透出染料分子，请采用至少截留分子量 >10KDa的透析袋常温透析，最好每4个小时更换透析液，重复更换3次。随着透析袋内 DMF溶剂分子的透出，可能会有更多的游离罗丹明染料分子沉淀出来，离心取上清换透析袋再透析，直到样品没有沉淀、无染料透出为止。凝胶过滤法，比如除盐柱，也可以纯化标记产物，这个方法比较快捷，但是效率可能会不如透析法。

4在避光条件下，将纯化后的 dextran 样品储存在4℃冰箱，可至1个月。或者放-20℃冰箱，长期保存。