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2023年10月14日 14:39 来源：新维创生物科技（重庆）有限公司
1、用不含氨基的合适的缓冲液（eg.100mM磷酸钠，150mM NaCl, pH7.5）溶解抗体使其浓度达到1-5mg/mL。【注】：如抗体中有残留Tris或 glycine 污染，则需透析或者脱盐到合适的缓冲液内。
2、使用前，用适量去离子水或者无水DMSO溶解Cy3-NHS，使其摩尔浓度为抗体摩尔浓度的400倍，例如，待标记的IgG浓度为1mg/mL（eg 6.7µM），则溶解后Cy3-NHS的浓度为2.7mM；如待标记的IgG浓度为2.5mg/mL，则溶解后Cy3-NHS的浓度为6.75mM。
3、向抗体中加入适量Cy3-NHS试剂，以达到预期的标记效率。【注】：当用Cy3 NHS ester标记抗体或其他蛋白，亮度最高的偶联物其染料/蛋白的比率为4-12，取决于特定的应用。过高比率会增加非特异性背景，丧失抗体特异性结合，导致聚集。建议根据应用优化标记比率。
4、室温孵育60min（或更长）。
5、利用合适缓冲液透析或脱盐柱去除未反应的试剂。
6、分别在280nm和550nm检测Cy3-抗体的吸光值。
7、测定Cy3标记效率（DOL）和标记浓度。
注意：可参考本方法进行多肽，蛋白或者其他分子的标记，需要根据具体的实验体系对合适的标记缓冲体系，样本浓度，染料浓度等参数做出合适的调整。以上科研试剂，新维创生物均可以提供。
应用举例
用高于抗体摩尔浓度20倍的Cy3-NHS标记 0.1 mL山羊IgG（浓度为1mg/mL）。标记后脱盐去除未标记染料，在PBS中测定(1:5稀释)测定其A280和A555:
A280=0.2906
A555=0.9825
另：山羊IgG分子量为150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1
计算DOL如下：
By Equation 2 Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55µM
By Equation 3 Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039µM
By Equation 1 number of Cy3 per IgG=6.55µM/1.039µM=6.3
则计算Cy3-IgG protein 浓度为（mg/mL）：
By Equation 4 mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/mL
新维创生物科技（重庆）有限公司
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