具有增强光稳定性的菁荧光团衍生物新维创动态

需要高光稳定性的荧光应用通常依赖于使用溶液添加剂来增强荧光团的性能。本研究表明，环己四烯(COT)、4-硝基苯基醇(NBA)或Trolox与菁荧光团Cy5的直接或近端偶联显著增强了荧光团的光稳定性，而不会影响其固有的光谱特性。这种偶联是提高基于荧光的应用的有力手段，要求长寿命，不闪烁的荧光发射。

小有机荧光团是生物成像中强大的研究工具，使我们能够前所未有地深入了解细胞和分子过程。然而，它们的性能可能会受到不良的光物理性质的影响，这些性质限制了荧光量子产率和光漂白前发射的光子总数。这些问题包括瞬态(闪烁)和不可逆(光漂白)光致暗态转变。在需要高光照强度的单分子研究中，暗态转换尤其受到限制。这些问题对于波长较长的荧光团尤其常见，例如Cy5，广泛用于基于荧光共振能量转移的研究和要求高信噪比的应用。添加小分子溶液添加剂是在体外和体内减少荧光团闪烁和光漂白的有力手段。常见的添加剂包括三态猝灭剂(TSQ)，如环己四烯(COT)、4-硝基苄基醇(NBA)和6-羟基-2,5,7,8四甲基铬-2-羧酸(Trolox)，它们以浓度依赖的方式起作用，以降低眨眼率、暗态寿命和光漂白率。尽管有这些优点，但TSQs也有一些关键的局限性，包括水溶性差、膜渗透性和生物毒性问题。为了避免这些问题，本研究表明，TSQs与Cy5荧光团的直接或近端联系在脱氧和含氧环境中减少了眨眼和光漂白，其程度超过了在溶液中使用TSQs的情况。我们还观察到Cy5在活细胞中的性能增强，这表明这些新的荧光团衍生物可能具有体内应用价值。    

体外单分子研究表明，TSQs以浓度依赖的方式影响花青素荧光团的光物理性质，表明其作用模式是基于碰撞的。为了确定是否可以通过将有效的TSQ浓度提高到超过溶解度限制，同时绕过与毒性相关的问题来实现荧光团性能的进一步增强，我们合成了特异性的Cy5-TSQ偶联物，其中我们将COT, NBA或Trolox通过柔性的，12原子连接剂。我们制定了合成此类化合物的一般策略，首先将每个TSQ修饰为包含单个胺官能团，然后将其偶联到市售的双反应性N -羟基琥珀酰亚基酯(NHS)2-Cy5荧光团，以高效率(~ 30-60%)和纯度(>98%)产生单官能团的NHS- cy5 -TSQ物质。

TSQ -共轭Cy5荧光团的整体荧光测量表明，除了荧光量子产率的适度变化外，TSQ -荧光团共轭物的吸收和发射光谱与母体Cy5化合物的吸收和发射光谱在很大程度上无法区分。与Cy5相比，Cy5- cot、Cy5- nba和Cy5- trolox的量子产率分别提高了25%、不变和降低了20%。这种变化可能部分地反映了表观激发态寿命的变化。

为了评估这些荧光团衍生物，我们将每个化合物与胺和生物素功能化的21碱基对双链DNA寡核苷酸反应。利用宽视场全内反射荧光(TIRF)成像，我们在640 nm激光直接照射下，在单分子尺度上评估了表面固定的荧光团- dna复合物的光物理性质。我们使用典型的单分子成像条件和酶促氧清除系统从溶液中去除分子氧，并收集单个分子的荧光轨迹。利用隐马尔可夫模型分析了荧光态和暗态的动力学参数。我们在这里集中在最显著的荧光团光物理参数，平均停留时间在荧光(' on ')状态(τon)。    

在60 mW的激光头和~0.2 kW cm−2的成像面上，母体Cy5化合物的平均τ为4 s。单个痕迹经常表现出短暂的荧光，被暗态驻留打断，这是向三重态偏移的特征。与之前的观察结果一致，在溶液中加入1mm COT、NBA或Trolox，接近溶解度极限时，τon增加了5 - 12倍。

参考文献

Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability Roger B Altman, Daniel S Terry Zhou Zhou, Qinsi Zheng, Peter Geggier, Rachel A Kolster, Yongfang Zhao, Jonathan A Javitch, J David Warren & Scott C Blanchard*.Nature Methods  9,68–71 (2012). www.nature.com/articles/nmeth.1774