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2023年11月20日 10:54 来源：新维创生物科技（重庆）有限公司
荧光标记指将荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，具有无放射物污染、操作简便、容易观察等优点，可借助荧光特性对被标记对象进行定性、定位以及定量分析。荧光标记在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面显现出巨大潜能。
荧光染料如何标记蛋白？以及使用过程中有哪些注意事项？
荧光染料标记蛋白，主要包含以下步骤：
蛋白标记时蛋白溶液的配制，以下几点十分重要！
1、关于溶解：溶解蛋白时，要根据推荐的溶剂进行溶解，避免使用含伯胺 (例如 Tris，Glycine) 或铵离子的缓冲液，它们与待标记蛋白会发生竞争反应降低标记效率。低浓度的叠氮化钠 (≤3 mM 或 0.02％) 或 Thimerosal (≤0.02 mM 或 0.01％) 不会显著干扰蛋白标记，但是 20-50％ 的甘油会降低标记效率。
2、标记蛋白浓度：蛋白浓度过低会大大影响标记效率，一般浓度不小于 0.5 mg/mL。若蛋白浓度过低，可用超滤管浓缩蛋白。
注意事项：蛋白必须在不含伯胺和铵离子的缓冲液中，这些基团会和蛋白争夺结合位点，会影响标记效率。
蛋白溶液配好了，我们现在开始配染料溶液，使用无水 DMSO 配制染料溶液 (多为 10 mM )，染料在 DMSO 稳定性较好，剩余染料溶液可在 - 20℃ 分装保存 1 个月。如果是水溶解，染料有易被水解的性质，建议现配现用。
我们在标记时，首要注意的是染料和蛋白的配比问题，染料过少，反应不完全，标记量太少，染料过多，则不易纯化。通常，我们推荐染料与蛋白的摩尔比在 5:1-20:1。
此处我们以 CY3 为例，假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000)，用 100 µL DMSO 溶解一管 1 mg CY3 染料，则所需 CY3 体积为 3.95 μL，详细计算流程如下：
1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG): 2 mg/mL×0.5 mL/ 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol
2)mmol(CY3)=mmol(IgG)×10: 6.7×10-6 mmol×10=6.7×10-5 mmol
3)µL(CY3)=mmol(CY3)×MW(CY3)/mg/µL(CY3): 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol/0.01 mg/µL =3.95 µL
了解配比后，我们开始孵育，一般将染料和蛋白一起室温孵育 2 h 即可完成结合！
荧光标记结束后，我们需要纯化蛋白去掉多余未结合染料防止其对实验的干扰，常用的纯化工具为亲和层析柱和透析袋。
忙忙碌碌终于大功告成，那么如何检测我们是否标记成功呢，通常是以下几种：
1、直接肉眼观察，根据上面的纯化原理可以得知，如果得到的产物有颜色。我们默认标记成功；
2、荧光显微镜观察，通过荧光显微镜在对应通道进行拍摄，如果观察到特定形态荧光信号即为标记蛋白；
3、蛋白电泳实验，标记后蛋白本身分子量会增大，蛋白存在微小向上拖带可以证明标记成功（如果向下大范围拖带可能是蛋白发生降解）。
4、使用分光光度计测定 F（荧光素）和 P（抗体蛋白）的比值（F/P），F/P 的比值反映荧光蛋白的特异性染色质量，一般要求 F/P 的克分子比值为1～3。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，标记效率低。
新维创生物科技（重庆）有限公司
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