一、产品基础信息

• 中文名称：催产素-罗丹明

• 英文名称：Oxytocin-RB

• 常用缩写·别名：催产素红色荧光标记物／Oxytocin-Rhodamine B

• 规格：10mg/100mg/500mg

• 溶剂：水、PBS、DMSO；水相溶解性好

• 性状：红色至深红色固体（示意，具体以COA为准）

二、可反应位点只有一处

催产素由九个氨基酸残基组成，第 1 位与第 6 位的半胱氨酸之间形成二硫键，把线性肽闭合成一个大环，C 端为酰胺化形式。

按官能团清点：序列中没有赖氨酸，因此没有侧链伯胺；C 端已酰胺化，没有游离羧基；精氨酸、组氨酸这些带侧链碱性的残基也不在序列中。剩下的可反应基团只有两类，第 1 位半胱氨酸的 α-氨基，以及第 2 位酪氨酸的酚羟基。

酚羟基与活化酯的反应速率比伯胺慢两个数量级以上，在中性至弱碱性条件下基本可以忽略。因此在实际操作窗口内，能接上罗丹明的位点只有 N 端这一个。

这个结论直接决定了两件事：标记度的理论上限是 1，标称大于 1 的批次必然含有未除净的游离染料；以及产物不需要考虑异构体问题，只要环保持完整，得到的是单一化合物。

三、标记 pH 的两难

N 端 α-氨基的 pKa 在 7.7 至 8.0 之间。pH 越低，游离氨基比例越小，标记速率越慢；pH 升到 8.5，游离比例提高，反应明显加快。

问题出在二硫键。二硫键在碱性条件下会被碱催化断裂，机理是 β-消除：半胱氨酸残基的 α-氢被夺去，二硫键随之裂开，生成脱氢丙氨酸与硫醇。pH 越高，速率越快，pH 9 以上放置数小时就足以让相当比例的环打开。

两条要求方向相反。可行的折中是把 pH 压在 7.8 至 8.2，同时用三个手段补回速率：降低温度到 4 ℃、延长反应时间、提高染料当量。低温同时抑制碱解与水解，是这里较有效的一项。

另一条路线是在中性条件下先做一次温和的还原，把二硫键暂时打开、标记完成后再氧化闭环。染料当量的提高有上限。当量过高时，未反应的染料在纯化步骤中成为主要负担，残留的活化酯还会与肽上的酪氨酸缓慢反应，生成副产物。常规做法是控制在一到三当量，靠延长反应时间与降低温度来补速率，而不是继续加染料。反应终点用薄层色谱或色谱判断，看到原料峰不再下降即停止。

四、环打开后的信号表现

环打开后，肽从球形构象变为柔性链，第 2 位的酪氨酸从环内暴露到溶液中，罗丹明所处的微环境极性升高。结果往往是荧光强度上升。

这一点容易造成误判：信号变亮被当成标记成功，实际上可能是结构已经破坏。判断需要换一个指标，例如反相色谱上的保留时间，开环体的疏水性降低，保留时间通常后移；或用非还原条件电泳看条带位置；也可以在还原与非还原两种条件下各测一次，比较差异。

若产物用于结合类实验，环的完整性比标记度更要紧。开环体的结合能力下降幅度往往大于标记度不足带来的影响。

五、纯化与保存

这类产物不适合用透析纯化。九肽的分子尺寸小，透析膜对它的截留有限，游离罗丹明与产物会一起透出，反复换液只能把两者一起稀释，分离效果差。

可用的是脱盐柱或凝胶过滤，把游离染料与小肽按尺寸差分开；也可用截留规格 3 kDa 的超滤膜离心洗涤，产物留在膜上，游离染料进入滤液。超滤的优点是快，缺点是膜对肽有一定吸附，回收率需要预先测一次。

纯化是否到位不能只看颜色。游离罗丹明与产物的颜色相同、荧光都强，肉眼看不出来。浓度测定要避开染料的干扰。罗丹明在可见区有强吸收，用它算浓度较为方便，前提是样品中没有游离染料。若纯化后仍混有少量游离染料，按可见吸收算出的浓度会偏高，后续按此浓度做的结合实验，上样量实际偏低。较稳妥的做法是用肽骨架的吸收做交叉核对，两者算出的浓度接近时，数值才可信。

保存上，固体冻干后 −20 ℃ 避光可长期放置；溶液状态在 4 ℃ 下不宜超过一周，缓冲液中的微量金属离子会加速二硫键的氧化交换。若必须长期保存溶液，可充惰性气体并分装。

六、Q&A

Q：标记度标称 1.5 的批次能用吗？

不建议。该肽只有一个可反应位点，标记度不可能超过 1。标称超过 1 说明产物中残留游离罗丹明，这部分染料在实验中会均匀分布在体系里，抬高低浓度区的读数，使分布判断失真。可以自行纯化后复测，或改用标注明确的批次。

Q：标记时一定要避氧吗？

建议避氧。溶解氧会通过金属离子催化的氧化反应改变二硫键的状态，既可能促成分子间二硫键交换，也可能生成磺酸类副产物。操作上不必做到严格无氧，用缓冲液预先脱气、反应容器充惰性气体即可。

Q：产物在 4 ℃ 放了两周，还能用吗？

要看环是否完整。取少量跑一次反相色谱，若出现保留时间后移的新峰，说明部分开环，这部分不能算作有效产物。两周的溶液放置对这类肽已偏长，建议以后按单次用量分装冻存。

本产品仅供科研使用，禁止用于任何人体实验。

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