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2026年11月05日 15:16 来源:https://xwcbio.com/index.php?id=347
Q1:CY5-NHS能标记什么?抗体标记度怎么控制?
A:NHS 活性酯与伯胺反应——赖氨酸 ε-氨基、蛋白 N 端、氨基修饰的寡核苷酸,在 pH 7.2–8.5 的磷酸或碳酸氢盐缓冲液中室温反应 1–2 小时生成稳定酰胺键。反应体系中不能含 Tris、甘氨酸等胺类缓冲液或游离氨基酸,否则会竞争消耗染料。按染料与蛋白摩尔比 3:1 起步逐步上调,标记后用脱盐柱或超滤除去游离染料,再依据 670 nm 与 280 nm 吸光值换算每个分子的染料数;抗体一般控制在 2–6,过高易聚集并损失结合活性。
Q2:普通型和 Sulfo 型怎么选?
A:发色团一致,最大激发约 649–651 nm、最大发射约 670 nm,区别在溶解性。普通 Cy5-NHS 脂溶,需用无水 DMSO 或 DMF 配高浓度母液再稀释,有机共溶剂终浓度建议不超过 10%,对易变性蛋白不友好。Sulfo-Cy5-NHS 带磺酸基、可直接在水相反应,无需助溶且能减少蛋白聚集,适合对有机溶剂敏感的抗体和多肽;代价是分子带负电,可能改变蛋白等电点,也不利于需要穿膜的活细胞内标记。
Q3:荧光比预期弱,常见原因有哪些?
A:一是 NHS 酯水解,干粉吸潮后母液数分钟内失活,需干燥分装、−20 ℃ 避光保存,回温到室温再开盖,现配现用;二是激发线不匹配,633 nm 氦氖激光只能激发到约 60% 峰值,647 nm 氪/氩激光或 640 nm LED 接近 98%,信号差近一倍,采集窗口设 660–690 nm;三是标记后染料间距离过近发生聚集淬灭,降低染料负载量或反应体系中加入低比例助溶即可改善。干粉与母液全程避光操作。
点击链接,查看产品详情:CY5-NHS
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